Институт биоорганической химии имени академика А.С.Садыкова АН РУз

НАУЧНЫЙ ОТЧЕТ

об эффективности и безопасности применения лекарственного препарата Рутан в лечении вирусного заболевания, включающего все штаммы гриппа и больных с COVID-19 легкой и средней тяжести

Коронавирусы (CoV) представляют собой одноцепочечные вирусы с положительной РНК, которые вызывают тяжелые инфекции дыхательных путей, печени и различных органов у людей и многих других животных. За 20 лет двадцать первого века уже произошло три вспышки глобальных эпидемий, вызывающих CoV, включая SARS (2003), MERS (2012) и COVID-19. Недавно возникшее инфекционное заболевание CoV (COVID-19) стало всемирной пандемией, которую необходимо контролировать. Существует настоятельная необходимость в исследованиях и разработках лекарств и вакцин против COVID-19.

Было подтверждено, что COVID-19 вызван новым коронавирусом (SARS-CoV-2), геном которого был секвенирован в начале января 2020 года. Геномная последовательность SARS-CoV-2 очень похожа на последовательность SARS-CoV с примерно 79,6% идентичностью последовательности и остается стабильной до настоящего времени. Структура коронавируса представлена лабильными и консервативными белками. Покрывающие поверхность коронавируса белки-шипы (S-белок) в CoV относятся к лабильным белкам, способным мутировать и образовывать новые штаммы коронавируса.

Различные терапевтические агенты против COVID-19 нацелены на одну или несколько стадий репликационного цикла. Механизм репликации COVID-19 внутри клетки и возможные мишени для лекарств показаны на рисунке 1.

Консервативные белки коронавирусов, представленные протеазой 3СL и РНК-зависимой РНК-полимеразой, гомологичны по своей структуре на 90% [Hackbart M. et al. Proc Natl Acad Sci., 2020; Mu J. et al. Sci China Life Sci., 2020] и играют определяющую роль в размножении и функционировании вируса CoV в организме.

 

 

Рисунок 1. Предлагаемый механизм действия препаратов, применяемых при SARS-CoV-2.

Белок SARS-CoV-2 spike (S) связывает ангиотензин-превращающий фермент 2 (ACE2) на клеточной поверхности на клетках-хозяевах.

Вирусный геном доставляется в цитозоль хозяина путем 1) прямого слияния с плазматической мембраной после расщепления и активации трансмембранной сериновой протеазы типа II TMPRSS2 или 2) с использованием эндоцитарного аппарата клетки-хозяина, в котором эндоцитированные вирионы подвергаются стадии активации в эндосоме. Вирусный геном также функционирует как информационная РНК, которая транслируется в белки, такие как 3CLPro, папаин-подобная цистеиновая протеаза (PLpro) и RdRp, механизмами клетки-хозяина. RdRP необходим для репликации вируса и поэтому является привлекательной мишенью для препаратов против SARS-CoV-2.

Роль 3СL протеазы заключается в расщеплении полипротеина 800 кД, образованного при транскрипции генома вируса в 11 участках. При расщеплении протеазами, образуются четыре структурных белка и ряд функциональных белков: РНК-зависимая РНК полимераза (nsp12), хеликаза/трифосфатаза (nsp13), рибонуклеаза (nsp14, nsp15), РНК-метилтрансфераза (nsp14, nsp16) и другие белки, на основе которых происходит сборка новых вирусов и всех негативных действий вируса, включая воспаление и цитокиновый шторм.

Лопинавир/ритонавир в качестве ингибиторов протеаз подавляют протеолиз. Лопинавир/ритонавир специфически ингибирует протеазу 3CLpro. Рибавирин и фавипиравир обладают широкой противовирусной активностью и могут ингибировать репликацию РНК SARS-CoV-2. Фавипиравир и ремдесивир ингибируют РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), что приводит к снижению синтеза РНК.

 

3СL протеаза (3СLPro) в SARS-CoV и SARS-CoV-2 имеет идентичность последовательности 96,1%, что делает ее идеальной мишенью для широкого спектра анти-CoV препаратов. Протеазы такого типа широко распространены у вирусов, сходных с коронавирусами таксономических групп, и действуют по сходному механизму. Ингибирование протеазы позволит остановить размножение вируса и существенно уменьшит распространение и функционирование патогенных вирусных белков.

Ряд ингибиторов протеазы, использующихся для лечения ВИЧ, гриппа, гепатита С, были предложены в качестве возможных лекарственных препаратов для лечения COVID-19.

Калетра (комбинация двух ингибиторов протеазы Лопинавир/ритонавир (LPV/r) с фиксированным соотношением компонентов, широко используемая в качестве антиретровирусного препарата. Создавалась для лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). В настоящее время применяется для лечения COVID-19.

 

Лопинавир                                          Ритонавир

 

Наиболее часто используемая доза Лопинавира/Ритонавира в схеме лечения COVID-19 составляет 400 мг/100 мг два раза в день, срок лечения до 14 дней. Препарат обладает побочными эффектами, наиболее частыми из которых являются диарея, тошнота, рвота, гепатотоксичность. Стоимость препарата на курс лечения 2,2 млн. сум.

Рибавирин – ингибитор протеазы, обладающий активностью против обширных РНК- и ДНК-вирусов. Во время вспышки тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) в 2003 году и ближневосточного респираторного синдрома (MERS) в 2012 году рибавирин использовался для антивирусной терапии.

 

 

Рибавирин

 

В настоящее время применяется для лечения COVID-19. Применяемая доза при лечении COVID-19 составляет по 500 мг, 2–3 раза в день в течение 10 дней в комбинации с интерфероном или лопинавиром/ритонавиром [National Health Commission of the People’s Republic of China. COVID-19 diagnosis and treatment plan (trial version 7). 2020]. Применение препарата для терапии COVID-19 в высоких дозах вызывает побочные эффекты в виде прогрессирующей анемии, гипомагниемии, гипокальциемии, брадикардии. Стоимость препарата на курс лечения 0,400 млн. сум.

Другими лекарствами - ингибиторами 3СL протеазы, способными подавлять вирус SARS-CoV-2, являются боцепревир, пероральный ингибитор протеазы вируса гепатита С (HCV) прямого действия; телапревир, лекарство от гепатита С, и нелфинавир, антиретровирусный препарат, используемый для лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Основным недостатком их применения при лечении COVID-19 является малая эффективность и поэтому данные препараты не нашли широкого применения.

Другой важной системой в размножении вируса является РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) - ключевой компонент репликационного аппарата вируса для создания множественных копий генома РНК. RdRp в различных вирусах очень похожи и не аналогичны человеческой полимеразе, поэтому разработка ингибиторов RdRp является потенциальной терапевтической стратегией без риска перекрестных помех с человеческими полимеразами и эффективным лекарственным препаратом против COVID-19. Ингибирование РНК-полимеразы уменьшает размножение вируса. В качестве ингибиторов РНК-полимеразы – для лечения COVID-19 применяются следующие противовирусные препараты:

Ремсидивир – ингибитор РНК зависимой РНК-полимеразы препятствует размножению вируса.

 

Ремдесивир

 

Создавался для лечения лихорадки Эбола (2015) и до пандемии COVID-19 не нашел широкого применения из-за множества побочных эффектов. Применяемая доза против вируса COVID-19 – 200 мг в день, поддерживающая доза - 100 мг внутривенно в течение 9-10 дней. В настоящее время применяется во многих странах. Недостатком препарата является ряд серьезных побочных явлений, таких как рост печеночных ферментов, диарея, сыпь, нарушение почечной функции, артериальная гипотензия. Курс лечения от 6 до 10 ампул. Стоимость препарата на курс лечения 3,5 млн.сум

Фавипиравир (Япония) – аналог Авифавир (Россия) ингибирует РНК зависимую РНК-полимеразу.

 

Фавипиравир

 

Создавался для лечения всех подтипов штаммов вируса гриппа, включая типы A, B и C. Применяется в лечении COVID-19 во многих странах. Применяемая доза 1600 мг – 2 раза в сутки в 1 день, далее по 800 мг – 2 раза в сутки с 2 по 10 день. Препарат противопоказан пациентам с гиперчувствительностью, тяжелой печеночной и почечной недостаточностью. Стоимость препарата на курс лечения 1 млн.сум

Применяемые в настоящее время препараты являются либо ингибиторами РНК-полимеразы, либо ингибиторами 3СL протеазы, поэтому для лечения часто применяют комбинированную терапию, включающую введение «коктейля» или комбинации антиретровирусных средств, как в случае лечения с инфекцией ВИЧ-1 и СПИДом [Collier AC, Coombs RW, Schoenfeld DA, Bassett RL, Timpone J, Baruch A, Jones M, Facey K, Whitacre C, McAuliffe VJ, et al. 1996. Treatment of human immunodeficiency virus infection with saquinavir, zidovudine, and zalcitabine. AIDS Clinical Trials Group. N Engl J Med 334: 1011–1017].

В последние годы проводится интенсивный поиск ингибиторов 3СL протеазы и РНК зависимой РНК-полимеразы среди полифенолов растительного происхождения как потенциальных противовирусных препаратов против SARS-COV-2. Биологически активные вещества, особенно гидролизуемые танины, флавоноиды, катехины и др. привлекли большое внимание ведущих исследователей в мире и они могут быть использованы для разработки лекарств против коронавируса без побочных эффектов [Satyam Singh et al. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics 2020; Borgio et al. Arch. Med. Sci., 2020].

В ряде исследований приводятся данные, что подобранные композиции, включающие несколько флавоноидов, могут быть более эффективными благодаря различной степени аффинного взаимодействия с несколькими мишенями, что в еще большей степени позволяет реализовать преимущества полимишеневых механизмов действия этих соединений.

В Институте биоорганической химии Академии Наук Республики Узбекистан в течении 10-15 лет проводились изучения препарата Рутан, выделенного из растения Сумах дубильный Rhus coriaria (Totum).

Рутан создавался для лечения вирусов гриппа А и В [патент UZ IAP 04524 «Средство, обладающее противогриппозным действием» 31.07.2012].

Исследования общей токсикологии Рутана показали, что он относится к V классу нетоксичных веществ, не обладает кумулятивными свойствами, не оказывает токсического влияния на параметры периферической крови, патоморфологию почек, печени и внутренних органов у экспериментальных животных при длительном применении. Исследования специфической токсикологии показали, что препарат не обладает местно-возбуждающим, аллергическим, мутагенным, иммунотоксическим, тератогенным и эмбриотоксическим действиями.

Было также обнаружено, что препарат Рутан проявляет антирадикальную активность в отношении стабильного свободнорадикального ДФПГ (1,1-дифенил-2-пикрилгидразина) и предотвращает окисление липидов и белков в биомембранах. Высокая антиоксидантная активность препарата была продемонстрирована на модели перекисного окисления липидов, индуцируемого ферментативным Fe²⁺/аскорбатом в митохондриях.

Рутан, таблетки 0,25 мг, был разрешен к применению в медицинской практике МЗ РУз с 2015 г. как противовирусный препарат, обладающий высокой активностью против широкого спектра РНК-вирусов: на штаммы вирусов гриппа А и В, аденовирусы, парамиксовирусы, вирус герпеса, цитомегаловирус.

Учитывая отсутствие побочных действий и малую токсичность Рутана, разрешено применение взрослым и детям в возрасте от 6 лет для профилактики и лечения гриппа и других респираторно-вирусных инфекций, а также против легкой формы коронавируса SARS COV-2. (Инструкция применения, утвержденная ГУП «Государственный центр экспертизы и стандартизации лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Агентства по развитию фармацевтической отрасли при Министерстве Здравоохранения Республики Узбекистан прилагается).

В профилактических целях препарат может применяться в любые сроки, в том числе и непосредственно после контакта с возбудителем инфекции.

Для установления эффективности лекарственного средства Рутан, обосновывающей целесообразность использования данного препарата для лечения COVID-19 инфицированных больных, совместно с учеными Синцзяньского Института Физики и Химии проф. Haji Akber AISA, Шанхайского института Материи и Медика проф. Jingshan SHEN и Уханского института вирусологии проф. Gengfu XIAO Китайской Академии наук, являющимися одними из мировых лидеров по скринингу биологически активных соединений, был проведен цикл исследований по противовирусному действию in vitro препарата Рутан против коронавируса SARS-COV-2 и было обнаружено, что препарат Рутан эффективно ингибирует две жизненно важные ферментные системы вируса SARS-COV.

 

Исследование ингибирующего действия Рутана на активность 3CLpro вируса SARS-CoV-2

В экспериментах in vitro показано ингибирование Рутаном ферментативной активности 3CLpro в системе коронавирусной инфекции.

В качестве препарата сравнения взят Байкалеин – флавоноид растительного происхождения, ингибирующий репликацию вируса с высокой активностью посредством блокировки основной вирусной протеазы 3CLpro, перспективный в качестве нового противовирусного препарата для лечения COVID-19, но до настоящего времени не прошедший предклинические и клинические испытания [Hongbo Liu et al. J Enzyme Inhib Med Chem, 2021].

Изучена зависимость эффективности ингибирования от концентрации Рутана и определено, что в концентрации 0,5 мкМ препарат ингибировал протеазную активность 3CLpro на 17,7%, с повышением концентрации Рутана до 50 мкМ его ингибирующая активность повышалась до 97,5%.

 

 

А                                                                                         Б

Рисунок 2. Ингибирование 3CL протеазы SARS-COV-2 А. Рутаном Б. Байкалеином

Изучение ингибирующей активности Рутана и флавоноида Байкалеина показало, что для Рутана IC₅₀ равен 2,9, а для Байкалеина 0,94 по отношению 3CL протеазы в SARS-CoV-2, что показывает, что Рутан в 3 раза менее активен, чем Байкалеин – препарат, не прошедший в настоящее время предклинические и клинические исследования (Рис.2 ), но в 17 раз эффективнее Калетры (IC₅₀₌50,0), применяемой в настоящее время.

Таким образом, было подтверждено, что в настоящее время препарат Рутан является наиболее эффективным ингибитором протеазы 3CLpro в SARS-CoV-2, тем самым эффективно подавляет образование структурных и функциональных белков, вызывающих патологические и воспалительные процессы.

 

Исследование ингибирующего действия Рутана на активность РНК зависимой РНК-полимеразы вируса SARS-CoV-2

При инфицировании клетки вирусом SARS-CoV-2, основной задачей вируса является обеспечение формирования новых капсид вируса. Процесс инфицирования запускается синтезом вирусной РНК. РНК зависимая РНК-полимераза использует геномную РНК в качестве матрицы для копирования генетического материала вируса. Ингибирование РНК зависимой РНК-полимеразы позволит уменьшить репликацию и размножение вируса.

Изучение ингибирующего действия Рутана на активность РНК зависимой РНК-полимеразы вируса SARS-CoV-2 проведено на различных моделях:

1. В экспериментах показано ингибирование Рутаном ферментативной активности RdRP в системе коронавирусной инфекции.

В качестве препарата сравнения взят Мирицетин - флавоноид природного происхождения, являющийся ингибитором обратной транскриптазы вируса лейкемии и вируса иммунодефицита человека. Мирицетин взят в качестве модели, как наиболее близкое соединение по природе происхождения. В настоящее время исследовательская группа разработчиков Китая работает над клиническими испытаниями и внедрением в производство Мирицетина.

В проведенных экспериментах показано, что Рутан обладает ингибирующей активностью в отношении RdRP SARS-CoV2 в концентрации IC₅₀ 291 нМ, как показано на рисунке 3.

 

А                                                                                   Б

Рисунок 3. Ингибирование RdRP SARS-CoV-2 А. Рутаном Б. Мирицетином

 

Таблица 1. Эффективность ингибирующей активности Рутана и Мирицетина на фермент RdRP вируса SARS-CoV-2

 

Сравнение ингибирующей активности Рутана с Мирицетином показало, что Рутан ингибирует RdRP SARS-CoV-2 в 3,8 раза эффективнее, чем Мирицетин.

Таким образом, подтверждено, что препарат Рутан является ингибитором РНК-зависимой РНК полимеразы, предотвращающим репликацию и размножение вируса в клетке.

2. В экспериментах in vitro на культуре клеток Vero E6, инфицированных SARS-CoV-2 показана противовирусная активность Рутана по отношению вируса SARS-CoV-2. В качестве препарата сравнения был взят Ремдесивир.

В проведенных экспериментах показано, что значение эффективной концентрации EC₅₀ для Рутана проявляется в концентрации 5,8 мкМ (см.рис.4.А). Препарат сравнения Ремдесивир в тех же клетках достигает значения эффективной концентрации ЕС₅₀ в дозе 2,0 мкМ (см.рис. 4.Б).

 

                                        А                                                                    Б

Рисунок 4. Противовирусная активность по отношению SARS-CoV-2 в клетках Vero E6. А. Рутана Б. Ремдесивира.

 

Сравнение противовирусной активности Рутана с Ремдесивиром показало, что эффективная противовирусная концентрация ЕС₅₀ Рутана по отношению к вирусу SARS-CoV-2 в 2,9 раза меньше, чем у Ремдесивира.

Несмотря на то, что действие Рутана проявляется в меньшей активности, Рутан, что очень важно, обладает двойным механизмом действия, одновременно ингибируя 3CL протеазу и РНК зависимую РНК-полимеразу, в то время как Ремдесивир – монопрепарат, ингибирующий только РНК-полимеразу. Кроме того, преимуществом Рутана является его безвредность и безопасность применения.

Таким образом, на примере SARS-CoV-2 показано, что препарат Рутан эффективно ингибирует две жизненно важные ферментные системы вируса:

1. Ингибирует функцию ключевого фермента гидролазы 3CL вируса SARS-CoV-2 in vitro - в 17 раз эффективнее Калетры, применяемой в настоящее время, что указывает на возможность эффективного подавления размножения вируса in vivo.

2. Ингибирует РНК-зависимую РНК-полимеразу SARS-CoV-2 (IC₅₀=291 нМ) в экспериментах in vitro в 3,8 раза эффективнее, чем Мирицетин. Подтверждено, что препарат Рутан является ингибитором РНК-зависимой РНК полимеразы, предотвращающим репликацию и размножение вируса в клетке.

Рутан также проявляет противовирусную активность в отношении SARS-CoV-2 в культуре клеток Vero E6 со значениями половины максимальной эффективной концентрации (ЕС₅₀), равными 5,84 мкМ. Значение ЕС₅₀ для Ремдесивира составляет 2,0 мкМ.

При создании лекарственного препарата наиболее важное значение имеет безопасность препарата для больного. Большинство из имеющихся препаратов, применяемых в настоящее время для лечения COVID-19, вызывают множество побочных эффектов. Рутан имеет преимущество перед применяемыми препаратами отсутствием побочных действий, лучшей переносимостью и безвредностью для организма (таблица 2).

 

Таблица 2. Сравнительная характеристика безопасности противовирусных препаратов, применяемых для лечения COVID-19

 

В процессе обсуждения перспективности применения Рутана против вируса SARS-CoV-2 возникли опасения, что препарат может вызывать “цитокиновый шторм”.

В связи с этим, совместно с Институтом иммунологии и геномики человека АН РУз был проведен большой цикл исследований по изучению иммунотропных, интерферониндуцирующих свойств препарата Рутан.

Изучение индукции основных интерферонов альфа (ИФН-альфа) и гамма (ИФН-гамма) и основных провоспалительных цитокинов ИЛ-1 бетта и ИЛ-6 под действием Рутана показало, что Рутан не обладает выраженным иммунотропным и иммуностимулирующим действием и является относительно слабым индуктором интерферона и не вызывает инициацию “цитокинового шторма” (Подробный отчет Института иммунологии и геномики человека АН РУз на сайте).

На сегодняшний день в республике и за рубежом проводится процесс патентования, поэтому некоторые исследования не представлены.

 

Клинические исследования препарата Рутан.

Для Рутана 100 мг успешно проведены клинические испытания в Институте Вирусологии МЗ РУз на базе ГУ «Специализированной больницы Зангиота №1 для лечения пациентов с коронавирусной инфекцией», в ходе которых в опытной группе больных проводился анализ лабораторных показателей, включающий ПЦР на COVID-19 во времени и определение уровня С-реактивного белка. Проведенные исследования показали, что:

1. На выборке 103 больных со среднетяжелым течением коронавирусной инфекции после приема Рутан 100 мг на 4-5 день госпитализации показатель ПЦР на COVID-19 был отрицательным, что показывает минимальную длительность вирусемии, а также отсутствовали случаи ухудшения самочувствия с развитием критических состояний, требующих проведение оксигенации.

2. В опытной группе применение Рутан 100 мг 2 раза в день показало выраженный противовоспалительный эффект, который проявлялся в статистически значимом снижении количества С-реактивного белка – основного медиатора воспалительного процесса при коронавирусной инфекции, а также сокращение длительности вирусемии.

Проведенные исследования позволяют широко рекомендовать препарат Рутан для лечения больных со среднетяжелым течением коронавирусной инфекции. (Отчет Института Вирусологии МЗ РУз на отдельном сайте).

С наступлением всемирной пандемии, вызванной SARS-CoV-2, учеными всего мира проводятся исследования по изучению использования полифенолов растительного происхождения и их производных как возможных перспективных веществ в качестве противовирусных препаратов для лечения и профилактики вирусных заболеваний в клинической практике.

В связи с этим, препарат Рутан, представляющий собой комплекс эллаготанинов, является эффективным противовирусным препаратом растительного происхождения против вируса SARS-COV-2, ингибирующий две ключевые ферментные системы вируса SARS-COV-2, проявляющимся за счет:

1. Ингибирования вирусной протеазы 3CLpro, тем самым подавляя образование структурных и функциональных белков, вызывающих патологические и воспалительные процессы.

2. Ингибирования РНК-зависимой РНК-полимеразы, предотвращая репликацию и размножение коронавируса в клетке.

Препарат Рутан не обладает выраженным иммунотропным и иммуностимулирующим действием, и, следовательно, не может быть причиной цитокинового шторма.

Препарат Рутан имеет преимущество перед применяемыми в настоящее время при лечении коронавирусной инфекции отсутствием побочных действий, лучшей переносимостью и безвредностью для организма, а также Рутан значительно дешевле по стоимости в сравнении с существующими применяемыми препаратами.

 

Основные работы, опубликованные в мире за последний год по коронавирусу:

1. Gao Y, Yan L, Huang Y, Liu F, Zhao Y, Cao L, Wang T, Sun Q, Ming Z, Zhang L, Ge J, Zheng L, Zhang Y, Wang H, Zhu Y, Zhu C, Hu T, Hua T, Zhang B, Yang X, Li J, Yang H, Liu Z, Xu W, Guddat LW, Wang Q, Lou Z, Rao Z (2020) Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus. Science. https ://doi.org/10.1126/scien ce. abb74 98

2. Hackbart M, Deng X, Baker SC (2020) Coronavirus endoribonuclease targets viral polyuridine sequences to evade activating host sensors. Proc Natl Acad Sci USA 117:8094–8103

3. Lan J, Ge J, Yu J, Shan S, Zhou H, Fan S, Zhang Q, Shi X, Wang Q, Zhang L, Wang X (2020) Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. https ://doi.org/10.1038/s4158 6-020-2180-5s

4. Shang J, Ye G, Shi K, Wan Y, Luo C, Aihara H, Geng Q, Auerbach A, Li F (2020) Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2. Nature. https ://doi.org/10.1038/s4158 6-020-2179-y

5. Walls AC, Park Y-J, Tortorici MA, Wall A, McGuire AT, Vessler D (2020) Structure, function, and antigenicity of the SARSCoV-2 spike glycoprotein. Cell 180:281–292

6. Mu J, Xu J, Zhang L, Shu T, Wu D, Huang M, Ren Y, Li X, Geng Q, Xu Y, Qiu Y, Zhou X (2020) SARS-CoV-2-encoded nucleocapsid protein acts as a viral suppressor of RNA interference in cells. Sci China Life Sci 63:10

7. B.R. Beck, B. Shin, Y. Choi, S. Park, K. Kang Predicting commercially available antiviral drugs that may act on the novel coronavirus (SARS-CoV-2) through a drug-target interaction deep learning model Comput Struct Biotechnol J, 18 (2020), pp. 784-790, 10.1016/j.csbj.2020.03.025

8. Shannon A., Selisko B., Le N., Huchting J., Touret F., Piorkowski G. et al. Favipiravir strikes the SARS-CoV-2 at its Achilles heel, the RNA polymerase. bioRxiv. 2020; (2020.05.15.098731; 2020.05.15.098731. [preprint]) https://doi.org/10.1101/2020.05.15.098731

9. A.D. Rathnayake et al. 3C-like protease inhibitors block coronavirus replication in vitro and improve survival in MERS-CoV–infected mice. Science Translational Medicine 19 Aug 2020: Vol. 12, Issue 557, eabc5332, DOI: 10.1126/scitranslmed.abc5332

10. Ibrahim Khalifai et al Therapeutic Effects of the Combination of Alpha-Lipoic Acid (ALA) and Coenzyme Q10 (CoQ10) on Cisplatin-Induced Nephrotoxicity Int J Inflam. 2020 Apr 9; 2020:5369797. doi: 10.1155/2020/5369797. eCollection 2020.

11. Abdo A. Elfikya and Eman B. Azzamb Novel guanosine derivatives against MERS CoV polymerase: An in silico perspective. J Biomol Struct Dyn. 2020: 1–9. doi: 10.1080/07391102.2020.1758789

12. F. Borgio, H.S. Alsuwat, W.M. Al Otaibi, A.M. Ibrahim, N.B. Almandil, et al. State-of-the-art tools unveil potent drug targets amongst clinically approved drugs to inhibit helicase in SARS-CoV-2// Arch. Med. Sci., 16 (3) (2020), pp. 508-518, 10.5114/aoms.2020.94567

13. Satyam Singh, Md Fulbabu Sk, Avinash Sonawane, Parimal Kar & Sushabhan Sadhukhan (2020) Plant-derived natural polyphenols as potential antiviral drugs against SARS-CoV-2 via RNA‐dependent RNA polymerase (RdRp) inhibition: an in-silico analysis, Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, DOI: 10.1080/07391102.2020.1796810

14. J. Ziebuhr, E.J. Snijder, A.E. Gorbalenya Virus-encoded proteinases and proteolytic processing in the Nidovirales J Gen Virol. 2000 Apr; 81 (Pt.4): 853-79. doi: 10.1099/0022-1317-81-4-853

15. Wrapp D, Wang N, Corbett KS, Goldsmith JA, Hsieh CL, et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 2020;367: 1260–1263. pmid:32075877

16. Yan R, Zhang Y, Li Y, Xia L, Guo Y, Zhou Q. Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science. 2020; 367:1444–8.

17. Ghosh R., Chakraborty A., Biswas A., Chowdhuri S. Evaluation of green tea polyphenols as novel corona virus (SARS CoV-2) main protease (Mpro) inhibitors – an in-silico docking and molecular dynamics simulation study. J Biomol. 2020:1–13.

18. Utomo R.Y., Meiyanto E. Revealing the potency of citrus and galangal constituents to halt SARS-CoV-2 infection. Preprints. 2020 doi: 10.20944/preprints202003. 0214.v1. 2020030214.

19. Das S., Sarmah S., Lyndem S., Singha Roy A. An investigation into the identification of potential inhibitors of SARS-CoV-2 main protease using molecular docking study. J Biomol. 2020:1–11.

20. Jo S., Kim S., Shin D.H., Kim M.S. (2020) Inhibition of SARS-CoV 3CL protease by flavonoids. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 35(1): 145–151. doi: 10.1080/14756366.2019.1690480.

21. Jin Z., Du X., Xu Y. et al. (2020) Structure of Mpro from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors (https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y)

22. McKee D.L., Sternberg A., Stange U., Laufer S., Naujokat C. Candidate drugs against SARS-CoV-2 and COVID-19. Pharmacol Res. 2020;157:104859.

23. Marinella M.A. Indomethacin and resveratrol as potential treatment adjuncts for SARS-CoV-2/COVID-19. Int J Clin Pract. 2020.

24. Wu C., Liu Y., Yang Y., Zhang P., Zhong W., Wang Y., Wang Q., Xu Y., Li M., Li X. Analysis of therapeutic targets for SARS-CoV-2 and discovery of potential drugs by computational methods. Acta Pharm Sin B. 2020;10: 766–788

25. Singh S., Sonawane A., Sadhukhan S. Plant-derived natural polyphenols as potential antiviral drugs against SARS-CoV-2 via RNA‐dependent RNA polymerase (RdRp) inhibition: an in-silico analysis. J Biomol. 2020:1–16.

26. Cheng L., Zheng W., Li M. et al. (2020) Citrus Fruits are rich in flavonoids for immunoregulation and potential targeting ACE2 (https://www.preprints.org/manuscript/202002.0313/v1)

27. Zhao Y, Zhao Z, Wang Y, Zhou Y, Ma Y, Zuo W. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov. bioRxiv 2020 Jan 26. doi: 10.1101/2020.01.26.919985

28. Li R, Qiao S, Zhang G. Analysis of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) from different species sheds some light on cross-species receptor usage of a novel coronavirus 2019-nCoV. J Infect 2020 Feb 21 [Epub ahead of print]. doi: 10.1016/j.jinf.2020.02.013.

29. W. Dai et al., Structure-based design of antiviral drug candidates targeting the SARS-CoV-2 main protease Science 10.1126/science.abb4489 (2020).

30. M. Wang, R. Cao, L. et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Res. 30, 269–271 (2020). doi:10.1038/s41422-020-0282-0

31. R. Lu, X. Zhao et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: Implications for virus origins and receptor binding. Lancet 395, 565–574 (2020). doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8

32. Y. Chen, Q. Liu, D. Guo, Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. J. Med. Virol. 92, 418–423 (2020). doi:10.1002/jmv.25681

33. John B. Moore and Carl H. June Cytokine release syndrome in severe COVID-19 Science 368 (6490), 473-474.DOI: 10.1126/science.abb8925originally published online April 17, 2020

34. M. Thoms et al., Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2 Science, 10.1126/science.abc8665 (2020).

35. Derek K Chu, Elie A Akl, et al. Physical distancing, face masks, and eye protection to prevent person-to-person transmission of SARS-CoV-2 and COVID-19: a systematic review and meta-analysis The Lancet June 2020 DOI: 10.1016/S0140-6736(20)31142-9